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生物蛋白质技术服务
(Biological protein technology services) Author: GenAsia 
蛋白水平技术服务
1、免疫学检测平台
1.1 ELISA
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA；指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。其原理：结合在固相载体表面的抗原仍保持其免疫学活性，酶标记的抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体）与固相载体表面的抗原起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入与酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
1.1.1 间接法ELISA检测
间接法ELISA主要用于检测抗体。首先用特异性抗原包被固相载体，加入待测的抗体，使之与包被在固相载体上的抗原结合，再加入酶标记的第二抗体，使之与待测抗体结合；反应后再加入底物显色，颜色的深浅与标本中待测抗体的量成正比。
服务内容 间接法测定抗体 样品要求  客户需提供待检测抗体和用于包被的抗原。 检测的样品为细胞培养上清、人和动物的血清、血浆。 样本收集后应立即-20℃保存，若长期保存应-80℃。 样本量的要求：若一个指标做复孔检测应不少于250ul，做单孔检测应不少于120ul。建议若客户样本量充足最好提供800ul以上。赛哲提供 完整的实验报告； 检测的相关数据； 服务说明 样本收集后，应立即按要求保存，切记：不能反复冻融。外地客户邮寄需要用干冰运输。邮寄前请与技术支持沟通确认。 ※ 间接法ELISA实验流程  1.1.2 竞争法ELISA检测 竞争法ELISA一般用于检测样品中某抗原或抗体的含量，很多常用的指标目前都有商品化的检测试剂盒。 服务内容 竞争法测定抗原 样品要求  客户需提供待检测抗体和用于包被的抗原。 检测的样品为细胞培养上清、人和动物的血清、血浆。 样本收集后应立即-20℃保存，若长期保存应-80℃。 样本量的要求：若一个指标做复孔检测应不少于250ul，做单孔检测应不少于120ul。建议若客户样本量充足最好提供800ul以上。赛哲提供 完整的实验报告； 检测的相关数据； 服务说明 样本收集后，应立即按要求保存，切记：不能反复冻融。外地客户邮寄需要用干冰运输。邮寄前请与技术支持沟通确认。 ※ 竞争法ELISA实验流程 原理：待测抗原和一定量的酶标抗原竞争与固定抗体结合；待检抗原含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。  1.1.3 夹心法ELISA检测 夹心法一般需要待测抗原中≥2个抗原决定簇，适合于大分子抗原的检测，一般分子量在5000D以上。 服务内容 双抗夹心法测定抗原 样品要求  客户需提供待检测抗体和用于包被的抗原。 检测的样品为细胞培养上清、人和动物的血清、血浆。 样本收集后应立即-20℃保存，若长期保存应-80℃。 样本量的要求：若一个指标做复孔检测应不少于250ul，做单孔检测应不少于120ul。建议若客户样本量充足最好提供800ul以上。赛哲提供 完整的实验报告； 检测的相关数据； 服务说明 样本收集后，应立即按要求保存，切记：不能反复冻融。外地客户邮寄需要用干冰运输。邮寄前请与技术支持沟通确认 ※ 夹心法ELISA实验流程 
1.2 Western Blotting
蛋白免疫印记是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中某种蛋白的方法，通过化学发光或呈色等技术检测其经电泳或斑点杂交后的固定于膜上的蛋白。具有快速，准确的特点，现已成为分析蛋白的常规技术之一，对蛋白进行定性和半定量分析。
1.2.1 蛋白抽提
为了能够进行后续的蛋白质实验，从组织或细胞中提取总蛋白并对其固液分离是非常必要的。
服务内容
总蛋白抽提 选用合适的蛋白Buffer溶解抽提后的目的蛋白
样品要求
 细胞量需＞6×106个，组织需＞300mg（新鲜或正确保存的细胞/组织样品）。建议提供目的蛋白阳性表达样品（有阳性表达的细胞或组织）。 赛哲提供 抽提后蛋白样品； 完整的实验报告； 1.2.2 蛋白定量 服务内容 根据样品裂解液成分及蛋白浓度等特性，选择特定的蛋白定量方法进行定量。 样品要求 新鲜或正确保存的蛋白样品。 赛哲提供 实验过程中产生的所有数据； 完整实验报告；
服务说明
由于Bradford法具有快速、可靠、与还原剂、离子螯合剂等兼容等特点，赛哲生物推荐使用该方法进行常规定量。Bio-Rad公司的蛋白质定量检测试剂盒 即以此法为依据的；若需使用特殊方法，请提前说明
1.2.3 免疫印记
蛋白印记(Western Blot)是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中某种蛋白的方法，通过化学发光或呈色等技术检测其经电泳或斑点杂交后的固定于膜上的蛋白。避免了放射性物质的使用，通过此方法对蛋白进行定性和半定量分析。
服务内容
通过预实验优化实验条件，选择蛋白浓度最适的上样量、一抗稀释度进行正式实验。
样品要求  裂解样品总蛋白量＞800μg/样品 细胞样品总蛋白浓度＞2mg/ml 组织样品总蛋白浓度：15-20mg/ml客户需要提供新鲜或正确保存的蛋白（不能反复冻融），建议提供目的蛋白的表达样品（纯蛋白或含有阳性蛋白表达的组织或细胞）作为阳性对照；若是诱导表达体系应用诱导前的空白载体对照。 服务说明 ² 检测蛋白的一抗：若随样品一起提供需要正确保存，避免污染和反复冻融；或是由我司代购 ² 每张PVDF/NC膜可检测1～8个样品 ² 每张膜中包括内参检测 赛哲提供 Western结果膜； 电子版图片； 完整的实验报告； ※ Western Blotting操作流程 蛋白质抽提 ⇒ 蛋白浓度测定 ⇒ SDS-PAGE ⇒ 转膜 ⇒ 封闭 ⇒ 一抗 ⇒ 洗膜 ⇒ 二抗 ⇒ 洗膜 ⇒ 显色膜 ⇒ 扫描
2．蛋白质互作
2.1 免疫沉淀
免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。用protein A/G预先结合在agarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的protein A/G就能达到吸附抗原的目的；免疫沉淀实验的操作步骤比较多，要想得到完美的实验结果，既需要高
质量的抗体，也需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能最终达到实验目的。
2.1.1 免疫沉淀
免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP) 是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G”特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。
服务内容
通过预实验优化实验条件，选择合适的IP细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂）进行正式实验；后续的检测实验。
样品要求
 客户提供原代培养细胞液或是新鲜的原代培养细胞裂解液 裂解样品总蛋白量＞1000μg/样品 细胞样品总蛋白浓度＞2mg/ml 组织样品总蛋白浓度：15-20mg/ml服务说明 ² 检测蛋白用抗体和免疫沉淀用抗体：随样品一起提供需要正确保存，避免污染和反复冻融； ² 客户提供与免疫实验不同种属的抗体，进行免疫沉淀后的Western检测，以避免交叉反应 赛哲提供 完整的实验报告； Western检测结果电子图片；
※免疫沉淀实验步骤
1) 收获细胞，加入适量细胞IP裂解液（含蛋白酶抑制剂），冰上或4℃裂解30min，12000rpm离心30min后，回收上清到新的EP管中；
2) 取少量裂解液以备western blot分析，将适量相应的抗体（一般1mg总蛋白加入1μg 抗体）加入到剩余裂解液中孵育数小时后，再加入10-15μl protein A/G-beads ，4℃轻柔摇晃孵育过夜；
3) 免疫沉淀反应后，在离心5min(4500rpm 4℃),弃去上清回收protein A/G-beads，用裂解液洗涤protein A/G-beads 3～4次，1ml/次；
4) 加入适量2×SDS加样Buffer,沸水浴10min
5) SDS-PAGE, Western blotting 或进行蛋白质谱分析。
2.1.2 免疫共沉淀
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。免疫沉淀实验用途非常广泛，而且基于最基本的免疫沉淀实验衍生出了许多免疫沉淀相关实验手段（比如免疫共沉淀、染色质免疫沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀）。因此，免疫沉淀实验的后续检测方法要视实验目的而定。
服务内容
1.细胞液裂解
2. 裂解液、抗体与protein A/G-beads孵育。
3. 抗原、抗体与protein A/G-beads复合物洗涤。
4. 共沉淀产物鉴定。
样品要求  客户提供原代培养细胞液或是新鲜的原代培养细胞裂解液、免疫沉淀用抗体及检测用抗体。 待检测样品可以是直接的待检测蛋白样品，也可以是细胞、组织或细菌样品。 免疫共沉淀(co-IP)通常使用宜用新鲜的蛋白样品为佳。服务说明 ² 检测蛋白用抗体和免疫沉淀用抗体：随样品一起提供需要正确保存，避免污染和反复冻融； ² 客户提供与免疫实验不同种属的抗体，进行免疫沉淀后的Western检测，以避免交叉反应 赛哲提供 完整的实验报告； Western检测结果电子图片； ※ 免疫共沉淀工作示意图  2.2 免疫组化 Immunohistochemistry 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)，并对其进行定性、定位、定量测定的一项新技术。 2.2.1 组织块切片 服务内容 用包埋好的组织蜡块制作石蜡切片 样品要求 用于石蜡包埋的组织，活检或手术切除标本应在2小时内取材或固定，避免组织自溶及抗原变性等影响免疫组化结果。 赛哲提供 石蜡切片 2.2.2 常规IHC染色 服务内容 1. 染色：常规免疫组织化学染色； 2. 实验结果显微镜成像； 3. 预实验和正式实验 样品要求  石蜡切片；冰冻切片；细胞爬片 组织切片厚度不大于50μm； 目的蛋白的一抗 赛哲代购，需提前说明； 用于石蜡包埋的组织，活检或手术切除标本应在2小时内取材或固定，避免组织自溶及抗原变性等影响免疫组化结果。 用于冰冻切片的组织，取材后应立即用液氮冷冻，然后放入-80℃保存赛哲提供 1张显微镜图片/张切片； 染色后的切片； 完整的实验报告； 服务说明 ² SP(三步法)或二步法免疫组化试剂盒进行检测，DAB显色/SABC显色； ² 实验与正式试验均按照切片张数进行收费； 2.2.3组织芯片常规IHC染色 服务内容 1. 染色：对组织芯片进行常规免疫组化染色。 2. 实验结果显微照相：芯片阵列中每个组织照一张典型结果图。 样品要求  客户需提供组织芯片； 目的蛋白的一抗（建议提供浓缩液）赛哲提供 1张显微镜图片/张切片； 染色后的切片； 完整的实验报告； 服务说明 ☆ 客户需进行预实验检测抗体稀释度等条件，可提供常规石蜡切片进行，预实验费用按照常规IHC染色收取； |